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蛋白染色只要五分鐘！

目標(biāo)蛋白可直接取出做質(zhì)譜分析

 

VisPRO^TM 蛋白負(fù)染色試劑盒為imidazole-zinc 負(fù)染色劑劑，能在5分鐘內(nèi)完成染色步驟，靈敏度高達(dá) 1 ng，并可相容于質(zhì)譜儀分析及各種下游實驗。

連結(jié)：http://www.visualprotein。。ｃｏｍ/vispro/index.php/proteomics/vispro-5-minutes-protein-stain-kit

一、產(chǎn)品特點：
1. 簡單且快速：染色過程只需5分鐘即可或得結(jié)果，不需要醋酸固定
2. 超高靈敏度：可達(dá)到 1ng 以下，優(yōu)于SYPRO Ruby、銀染法與CBB染色
3. 高應(yīng)用性：染色過后可進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)漬或、電泳溶離、質(zhì)譜儀蛋白質(zhì)鑒定與轉(zhuǎn)譯后修飾分析
4. 安全且容易操作：染液不具毒性且可室溫儲存

二、技術(shù)原理：
一般蛋白質(zhì)染劑為正染色法，藉由染劑分子和蛋白質(zhì)結(jié)合而達(dá)到觀察蛋白質(zhì)染色效果，換言之，有顏色的區(qū)域則代表是有蛋白質(zhì)的存在的地方；VisPRO^TM 蛋白負(fù)染色試劑盒跟正染色方式不同，為負(fù)染色法，其中溶液I 為 Imidazole 溶液，溶液II為鋅離子溶液。膠體先浸泡溶液I，Imidazole 會充滿在整個膠片，而蛋白質(zhì)處因空間已被占據(jù)，所以 Imidazole 無法進(jìn)入。隨后加入溶液II，鋅離子與與膠體內(nèi)的 Imidazole 結(jié)合形成白色沉淀，蛋白質(zhì)位置因無白色沉淀而呈現(xiàn)透明。


圖1：正染色與負(fù)染色法示意圖



圖2：VisPRO 蛋白質(zhì)負(fù)染色試劑與其他染色法操作時間比較圖


三、使用方法：
1. 電泳完成后，將膠體小心放入黑色染盒，加入Solution I 直到膠體*被覆蓋。
2. 將染盒置于震蕩擺動機(jī)，并使Solution I 和膠體作用 5 分鐘。
3. 倒掉 Solution I，加入 ddH2O 潤洗膠體，移除多余液體。
4. 于膠體周圍加入Solution II，并以手快速且大力的搖動染盒使染劑均勻分布，20-40 秒之內(nèi)將出現(xiàn)呈色影像 (蛋白質(zhì)位置為透明，其余膠體位置為白色)。
5. 當(dāng)膠體染色完畢，倒掉 Solution II，使用 ddH2O 潤洗膠體兩次將終止反應(yīng)。
6. 使用 Gel Lighting Plate 可得到更好的觀察效果，或是利用穿透式掃瞄機(jī)得到*的影像。

圖3：VisPRO 蛋白質(zhì)負(fù)染色試劑操作步驟圖


四、實驗結(jié)果圖：


圖4：VisPRO 蛋白質(zhì)負(fù)染色試劑與其他染劑的靈敏度比較，顯示 VisPRO 染劑聚有較佳的染色靈敏度


五、Q&A：
Q1： 請問經(jīng)由 VisPRO 染色后的膠體，若想將蛋白質(zhì)取出進(jìn)行質(zhì)譜分析，后續(xù)操作步驟為何?
A1： VisPRO染色后的膠體可直接取下使用，簡要步驟如下：(1) 用 ddH2O 清洗二維電泳膠體兩次，每次 10 分鐘。(2) 將 Blue tip 前端用剪刀剪下約 1 mm，接著垂直對準(zhǔn)在二維電泳膠體待取下的點。(3) 接著按壓 Blue tip 后輕輕旋轉(zhuǎn)，并確定膠體塊已被切下。(4) 把 Blue tip 倒插在 1.5 mL 離心管 (需可耐有機(jī)溶劑) 中，以離心管底端輕搞桌面，使膠體塊掉落在離心管中。(5) 加入 1mL 10% 醋酸溶液到 eppendorf，搖晃 30 分鐘達(dá)到膠體染色還原和蛋白質(zhì)固定效果。后續(xù)步驟可參考各質(zhì)譜設(shè)備廠商的建議步驟。
 
Q2： 請問VisPRO染色后的膠體，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印與后續(xù)Western blotting 實驗嗎?
A2： 可以。VisPRO 染色后的膠體，以 Native  電泳緩沖液潤洗兩次，*次搖晃潤洗 5 分鐘，第二次搖晃潤洗 10 分鐘。后續(xù)步驟請參照轉(zhuǎn)印設(shè)備廠商的建議步驟。
 
Q3： 請問 VisPRO 染色后的膠體，也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)溶離實驗嗎?
A3： 可以。VisPRO 染劑不會結(jié)合蛋白質(zhì)，相當(dāng)適合進(jìn)行蛋白質(zhì)溶離實驗進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。簡要步驟如下：(1) 使用解剖刀將含有蛋白質(zhì)膠體切下，并將膠體切0.5cm X0.5cm 大小左右。(2) 將切割完成膠體放置在 eppendorf 內(nèi)，加入 1mL 冰的電泳溶離液震蕩 5 分鐘進(jìn)行退染，移除膠體內(nèi)的染劑。(3) 倒掉電泳溶離液，再加入 1mL 冰的電泳溶離液震蕩 5 分鐘。(4) 倒掉電泳溶離液，將膠體取至電泳溶離槽，設(shè)定電流等 10mA，分別在 2 小時、4 小時、6 小時、24 小時分別收集 0.2mL 電泳溶離液即可。

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